肝细胞癌(HCC)是世界上第五大常见肿瘤，我国也是肝癌大国。几乎所有肝硬化患者和很大一部分慢性肝病患者最终会发展为肝纤维化和肝癌。由于大多数肝硬化患者无症状，而且HCC患者经常在晚期伴有肝炎和HCC症状，治疗的有效性往往受到限制。因此，寻找有效的生物标志物用于早期诊断检测、治疗评估非常有价值。

此前研究报道了外周血单个核细胞(PBMC)中AHNAK基因启动子甲基化水平与肝脏疾病严重程度增加相关，AHNAK可作为HCC早期诊断标志物。以及有研究也表明PBMC中STAP1甲基化也与乙型肝炎病毒(HBV)相关肝脏疾病的进展相关。

近日，一篇标题为Diagnostic and prognostic value of STAP1 and AHNAK methylation in peripheral blood immune cells for HBV-related hepatopathy的文章发表，研究者检测了慢性乙型肝炎(CHB)患者、代偿性肝硬化(CLC)患者、失代偿性肝硬化(DCLC)患者、肝细胞癌(HCC)患者和健康对照组外周血单个核细胞中AHNAK和STAP1的甲基化水平；还利用TCGA和GEO公共数据集评估了AHNAK和STAP1在肝脏疾病不同阶段甲基化和表达的差异和变化。结果显示AHNAK和STAP1在外周血免疫细胞中的甲基化可以作为HBV相关肝病的诊断标志物，STAP1甲基化可能是HBV相关肝细胞癌的潜在预后标志物。

(资料图片仅供参考)

研究纳入了302例HBV感染患者，其中慢性乙型肝炎(CHB)46例，代偿性肝硬化(CLC)46例，失代偿性肝硬化(DCLC)53例，肝细胞癌（HCC）157例。同时共招募了在采集外周血样本前均无肝胆疾病的22名健康志愿者作为对照组，与HBV感染患者共同进行PBMC或T细胞中AHNAK或STAP1的甲基化水平检测。

另外利用The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据库中HCC的甲基化数据，来证实AHNAK和STAP1与HCC及患者总体生存的相关性。利用基因表达综合(GEO)数据库中的DNA甲基化数据，研究不同类型肝硬化或HCC中AHNAK和STAP1的甲基化谱。

结果显示：

PBMC中STAP1甲基化水平与肝癌病程呈正相关，而AHNAK与病程呈负相关

STAP1和AHNAK的甲基化水平在PBMC和T细胞之间无明显差异(图1A,B)，STAP1甲基化水平在PBMC和T细胞中均与肝病严重程度呈正相关，而AHNAK甲基化水平与肝病严重程度呈负相关(图1C,D)。无论是在PBMC还是T细胞中，AHNAK和STAP1的甲基化水平均有显著差异。

图1.不同肝病患者外周血单个核细胞(PBMC)和T细胞中AHNAK和STAP1的甲基化水平

STAP1和AHNAK甲基化水平预测肝细胞癌特异性高

ROC曲线进行分析用以进一步验证PBMC中STAP1或AHNAK甲基化是否可作为肝脏疾病诊断的指标(图2)显示：

STAP1和AHNAK甲基化水平对鉴别CHB患者没有高度特异性。

STAP1甲基化对预测CLC患者也没有特异性。

T细胞中AHNAK甲基化可预测CLC。

PBMC中STAP1或AHNAK的甲基化可能是DCLC的预测因子。

STAP1或AHNAK在预测HCC方面表现出相当高的特异性。

图2.外周血单个核细胞(PBMC)STAP1或AHNAK甲基化是否可作为肝病诊断指标的ROC曲线

在公共数据集中，AHNAK和STAP1的甲基化水平在不同类型肝病中也有显著差异

研究者进一步利用GEO数据集分析了不同类型肝硬化或HCC中AHNAK和STAP1的甲基化水平来证实STAP1和AHNAK与肝脏疾病的相关性。

在GSE60753数据中，STAP1甲基化水平在肝硬化和HCC中存在显著差异(图3A)。

在GSE112679数据中，STAP1的甲基化水平也显著高于健康对照组和对照组CHB和HCC患者(图3B)。

在GSE112679数据中，AHNAK在肝硬化中的甲基化水平也明显高于其他类型，并且在HCC中明显高于良性肝病变和CHB(图3C)。

图3.基因表达综合数据集中不同类型肝病中AHNAK和STAP1甲基化的比较

肝癌组织中STAP1表达水平和AHNAK的甲基化水平降低

癌组织中STAP1的甲基化水平低于癌旁组织，但GSE78904数据中随访期间发生HCC的HBsAg携带者与未发生HCC的HBsAg携带者之间无明显差异(图4A)。

由于基因甲基化能够调节自身基因的表达，研究者分析了TCGA数据中原发肿瘤与正常组织之间STAP1的表达水平，发现STAP1在原发肿瘤中表达较低，而AHNAK在原发肿瘤中表达无显著性差异(图4B)。

图4.肝细胞癌(HCC)与正常患者AHNAK和STAP1的甲基化及表达比较

STAP1甲基化水平与年龄、性别、饮酒和抗HBe相关

在研究者新收集的HBV患者中：

PBMC和T细胞中STAP1甲基化水平与年龄呈正相关(图5A,B)。

男性患者PBMC中STAP1甲基化水平明显高于女性患者，而T细胞中无显著差异(图5C)。

饮酒患者PBMC中的STAP1甲基化水平明显高于非酒精患者。

抗HBe+患者的STAP1甲基化水平也更高。

在同一组患者中，由于AHNAK甲基化水平与STAP1甲基化呈负相关，老年患者的AHNAK甲基化水平较低，而女性患者、非酒精患者和不吸烟患者的AHNAK甲基化水平明显较高。

图5.STAP1的甲基化水平与年龄、性别、饮酒、外周血单个核细胞(PBMC)和T细胞中的抗HBe相关。

利用TCGA数据验证了HCC患者的临床特征与STAP1和AHNAK的关系。STAP1甲基化水平与术后rx tx(图6A)、性别(图6B)和年龄(图6C)相关，而AHNAK甲基化水平与额外的药物治疗(图6D)和性别(图6B相关)。

图6.癌症基因组图谱数据中STAP1或AHNAK甲基化水平与临床特征之间的关联

AHNAK和STAP1联合甲基化水平与患者总生存期相关

STAP1的甲基化与OS有显著相关性，提示是一个危险因素，但STAP1的表达水平与OS无显著相关性(图7A,B)。AHNAK的甲基化和表达与OS均无显著相关性(图7C,D)。但两者在OS中有显著性差异。当STAP1和AHNAK甲基化联合使用时，AHNAK位点低、STAP1位点高的患者OS较差(图7E)。

图7.AHNAK和STAP1甲基化和表达的预后价值

综上，AHNAK和STAP1在外周血免疫细胞中的甲基化组合检测可以作为HBV相关肝病的诊断标志物，STAP1甲基化可能是HBV相关肝细胞癌潜在预后标志物。

参考文献：

DOI：10.3389/fimmu.2022.1091103

作者：甲基化 叶子，转载请联系授权。

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